微生物檢驗的基本操作技術(shù)匯總！
無菌操作基礎(chǔ)知識
一、無菌操作技術(shù)
1、定義
是指在執(zhí)行實驗過程中，防止一切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法；
無菌操作技術(shù)是微生物實驗的基本技術(shù)，是保證微生物實驗和順利完成的重要環(huán)節(jié)。
2、內(nèi)容
無菌操作技術(shù)主要包括兩方面：
1）創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境。包括密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；
2）在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、凈臺的消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。
3、無菌操作原則
1）在執(zhí)行無菌操作時，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)，接種時必須穿工作服、戴工作帽，應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?/span>
2）在操作前20～30分鐘要先啟動凈臺和紫外燈，進行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼3次后使用。嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鑷子等；
3）從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不能觸及試管或平皿邊；
4）接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；
5）接種環(huán)或接種針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必須時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處；
6）吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。傾倒平板應(yīng)在凈臺內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時需反復(fù)用酒精燈燒。
二、無菌操作的環(huán)境要求
1、無菌室
（1）無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間；
（2）無菌室的消毒和防污染
?每日（使用前）紫外線照射（0.5~1小時）；
?每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒；
?每季度用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時），特殊情況下可增加熏蒸頻次。
（3）無菌室使用要求
①無菌室內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作臺面，不得存放與實驗無關(guān)的物品；
②無菌室使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外線，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕拭擦，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；
③處理和接種食品標本時，進入無菌室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。在無菌室內(nèi)如需要安裝空調(diào)時，則應(yīng)有過濾裝置。
2、凈工作臺
凈臺的使用與保養(yǎng)：
（1）風速穩(wěn)定，且符合要求；
（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上；
（3）讓凈臺預(yù)工作10－15分鐘；
（4）使用完畢后，用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈。
3、無菌器材
（1）滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等；
（2）消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺、手等。
（3）無菌間一般只允許放置無菌操作臺、轉(zhuǎn)椅等物品；無菌操作臺上一般只允許擺放以下物品： 酒精燈、打火機、接種針、消毒棉球、洗耳球、鑷子、油性筆、滅菌平皿、試管架、滅菌吸管、電子天平、250ml滅菌三角瓶、培養(yǎng)基、均質(zhì)器等。
三、無菌操作的基本技術(shù)
1、無菌接種操作
培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。
在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。
2、微生物檢驗過程中的無菌操作要求
（1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動作；
（2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放；
（3）在正火焰上方操作；
（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；
（5）在接種培養(yǎng)物時，協(xié)作應(yīng)輕、準；
（6）不能用嘴直接吸吹吸管；
（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。
3、無菌操作技術(shù)詳細圖解
（1）取菌技巧
（2）接種技巧
（3）錯誤示范
微生物的接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)
一、接種
1、接種定義
接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。
2、接種工具
在實驗室中，用得zui多的接種工具是接種環(huán)、接種針。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。
1．接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀
3、微生物檢驗常見接種方法
（1）劃線接種法
平板劃線分離法--分區(qū)劃線分離法
①用接種環(huán)先將培養(yǎng)物涂布于平板1區(qū)并作數(shù)次劃線，再在2、3̷̷區(qū)依次劃線；
②每劃完一個區(qū)域，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)滅菌一次，待冷后再劃下一區(qū)域；
③每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線1～2次，使接種量逐漸減少，以獲得單個菌落；
④其他操作與上述曲線劃線分離法相同。
（2）斜面接種法
主要用于經(jīng)劃線分離培養(yǎng)所獲得的單個菌落的移種，以及觀察細菌的某些培養(yǎng)特征。
以菌種移種為例，其接種方法是：
①取一菌種管和培養(yǎng)基管，置左手食指、中指、無名指間，拇指壓住兩管底部上側(cè)面，使菌種管位于外側(cè)，培養(yǎng)基管位于內(nèi)側(cè)；
②右手拇指和食指分別旋松兩管棉塞?；鹧鏈缇臃N環(huán)；
③以右手小指與手掌，小指與無名指分別夾取棉塞（先外管后內(nèi)管），將兩管口迅速通過火焰1~2次；
④將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取菌少許，迅速伸入待接種的培養(yǎng)基管中，在斜面底部向上劃一條直線，然后從底部起向上作曲折連續(xù)劃線，直至斜面上方頂端；
⑤取出接種環(huán)，火焰滅菌管口，塞上棉塞（先塞內(nèi)管）；zui后將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌放好；
⑥做好標識，置35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時。斜面培養(yǎng)一般形成均勻一致的菌苔。一般可觀察表面、透明度、色澤等特征。
（3）涂布接種法
涂布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用于計算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用于檢測化學(xué)因素對微生物的抑殺效應(yīng)。
原理：將一定濃度，一定量的待分離菌液移到已凝固的培養(yǎng)基平板上，再用涂布棒快速地將其均勻涂布，使長出單菌落而達到分離的目的。
（4）液體接種法（肉湯接種）
①如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管；
②滅菌接種環(huán)，從菌種管取菌，伸入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)基液體調(diào)和，使細菌混合于培養(yǎng)基的液體中。液體培養(yǎng)基一般以18~24小時培養(yǎng)后觀察生長特征。
肉湯培養(yǎng)可觀察如下幾項：
a.發(fā)育程度：有無生長、微弱、中等、旺盛；
b.混濁度：有無及程度（混、中等、微混、透明）、均勻混濁、有顆粒、絮狀生長；
c.沉淀：有無及量多少、性狀（粉狀、顆粒狀、絮狀、沾性）；
d.表面：有無生長、性狀（膜狀、環(huán)狀）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、顆粒、皺狀）；
e.其他：有無特殊氣味，色素。如果是糖發(fā)酵培養(yǎng)基則主要觀察是否產(chǎn)酸和有無氣體。
（5）穿刺接種法（半固體接種）
多用于保存菌種、觀察動力及厭氧培養(yǎng)等也可以用于觀察細菌的某些生化反應(yīng)。
①如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管；
②以滅菌接種針從菌種管取菌，垂直刺入培養(yǎng)基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達近管底部（但不能刺到管底），接種針應(yīng)沿原路退出；
③經(jīng)培養(yǎng)后半固體培養(yǎng)基可觀察到：沿穿刺線生長，線外的培養(yǎng)基清亮表示細菌無動力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴散生長，或整個培養(yǎng)基混濁表示細菌有動力。
二、分離純化
1、幾個定義
混和培養(yǎng)物：含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）；
純培養(yǎng)：如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture）；
分離純化：在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物，得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化。包括傾注平板法、涂布平板法、平板劃線法等等。
2、傾注平板法（倒平板）
將無菌培養(yǎng)皿放入生物安全柜或凈化臺中，然后分別倒入15ml已融化并且冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，待凝固之后，把這平板倒置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。單一細胞經(jīng)過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。整個操作過程應(yīng)嚴格按照無菌操作。
三、微生物的培養(yǎng)方法
微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、pＨ等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。通常分為：
1、一般培養(yǎng)法（需氧培養(yǎng)）
培養(yǎng)溫度：25~37℃ 。
2、厭氧培養(yǎng)方法
（1）簡易的厭氧培養(yǎng)法：
A、庖肉培養(yǎng)法
B、鐵絲圈厭氧培養(yǎng)法
C、焦性沒食子酸法
（2）厭氧罐法
（3）厭氧手套箱法
厭氧缸法：
厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)造成厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培養(yǎng)出來。
接種好標本的平板或液體培養(yǎng)基試管，可放入?yún)捬醺變?nèi)培養(yǎng)。
厭氧罐法：
裝入待培養(yǎng)的對象，然后密閉罐蓋，接著可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合氣（N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V）。
3、二氧化碳培養(yǎng)法
（1）燭缸法
（2）二氧化碳置換法
（3）化學(xué)法
每一升用重碳酸鈉0.4克與濃鹽酸0.35亳升加入。
（4）二氧化碳培養(yǎng)箱法
四、微生物常規(guī)鑒定技術(shù)
1、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察
（1）在固體培養(yǎng)基上，觀察：
菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等；
（2）在液體培養(yǎng)中：
表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等；
（3）半固體培養(yǎng)基穿刺接種：
觀察運動、擴散情況。
2、染色鏡檢
（1）染色原理
由于微生物細胞含有大量水分，機體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差， 必須進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
微生物中細菌、致病菌是很小的生物體，必須通過染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。
（2）染色方法
①簡單染色法
簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細菌染上顏色，觀察細菌的形態(tài)。
②復(fù)染色法
用兩種或多種染料染細菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。
（3）革蘭氏染色法
①原理
革蘭氏染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。
染色反應(yīng)呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；
染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細菌，用G―表示。
細菌對革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。
②細菌的革蘭氏染色步驟
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復(fù)染→水洗→干燥→觀察
A）取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同；
B）用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗；
C）加碘液媒染1min后水洗；
D）斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20～30s，隨即水洗；
E）用蕃紅染液復(fù)染30s，水洗；
F）用吸水紙吸掉水滴，待標本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。
